中国能源资讯网背景介绍
近年来，新冠病毒的传播让人们越来越意识到防止病毒在环境中传播的重要性。对于病毒的传播，传统的措施有空气/水过滤、化学消毒剂净化、热灭活和紫外线（UV）照射等方法，不过这些方法最大的限制在于物体表面与空气或水不同，物体表面不能连续消毒，频繁消毒表面在大多数情况下是不现实的。使用灭活病毒的材料或表面涂层可以避免对污染表面进行消毒。
理想的抗病毒表面材料的选择应满足以下要求：（1）高效的病毒灭活；（2）环境可持续性；（3）有限的毒性；（4）低成本和可扩展性。木质素是一种高度可用的植物衍生聚合物，满足这四个条件。当前，木质素用于抗病毒涂层的用途尚未探索。Alice Boarino等人将五种类型的水不溶性木质素（苏打木质素（SODA）、卡夫木质素（KRAFT）、有机溶剂木质素（ORGANOSOLV）、对苯二甲酸醛保护木质素（TALD）和酸催化酚化对苯二甲醛木质素（TALD-PAH））用作表面涂层材料。测试出其中两种木质素对单纯疱疹病毒2型（HSV-2）的强抗病毒活性。其抗病毒机制归因于涂层暴露于光时局部产生活性氧（ROS）。ROS包括过氧化氢（H2O2）、超氧化物阴离子（O2?)，以及可由分子氧产生的羟基自由基（HO·）。这些活性氧物种可通过与病毒衣壳和/或包膜中存在的氨基酸反应而引起病毒的氧化破坏。ROS介导的失活被认为是抗病毒表面的最佳机制，因为它涉及释放长期产生的无毒物质，从而消除了再生的需要。木质素酚可通过自由基过程氧化为醌，诱导分子氧还原为ROS。由于其在病毒灭活方面的高效性及其天然来源，该研究中描述的涂层代表了在实现负担得起且环境可持续的抗病毒和抗菌表面方面的新发展。
图文解读
Figure 1. (A) Schematic representation of a structural unit of the various lignins used in this study. Representative (B) optical micrographs, (C) SEM images, and (D) AFM images of coatings made of (I) TALD-APH, (II) Soda, (III) Kraft, (IV) Organosolv, and (V) TALD. (E) Plot of thehydroxyl group concentration per gram of lignin quantified by 31P NMR spectroscopy. (F) Plot of the average roughness (Ra) of the lignin coatings measured by AFM. (G) Plot of water contact angle of the lignin coatings. Statistical analysis was performed with a one-way analysis variance (ANOVA) with a Tukey comparison post hoc test (***: p < 0.001).
该课题组所研究的五种木质素的代表性结构单元如图1A所示，图1E显示了通过PNMR光谱测定的不同木质素的羟基含量。TALD-APH和苏打木质素是五种木质素中酚类含量最高的，研究发现它们在木质素表面的ROS生成中起着关键作用。通过在清洁和等离子体处理的硅晶片上旋涂50mg/mL二恶烷溶液来制备这些不同木质素的涂层。表面的光学显微照片如图1B所示。其扫描电子显微镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）图像（分别为图1C和图D）显示，旋涂的厚度为200 nm。在图1F中，比较了涂层的平均粗糙度（Ra），结果表明与其他三种木质素类型相比，TALD-APH和Soda木质素的粗糙度明显更大。为了研究旋涂过程中使用的聚合物浓度对木质素涂层结构和性能的影响，还从聚合物浓度为100和200 mg/mL的溶液中制备了卡夫木质素膜。与使用50 mg/mL溶液制备涂层时的0.18μm相比，在100mg/mL和200mg/mL溶液浓度下制备的膜厚度为0.6和1.6μm。图1G为对5中木质素涂层进行水接触角分析的结果。所有涂层均显示出相似的值，但无统计学显著差异。图1中所示的结果是在分析前在水中浸润24小时的旋涂膜上获得的，因此也说明了这些涂层的稳定性。
Figure 2 (A) Illustration of the wet-to-dry and wet-to-wet protocols used to assess surface virucidal activity. Created with Biorender (biorender.com). (B) Antiviral activities of lignin surfaces tested according to the wet-to-dry protocol. (C) Antiviral activities of lignin surfaces tested according to the wet-to-wet protocol. (D, E) Time course of virucidal activity: HSV-2 was exposed to Soda lignin coatings for different time periods and then serially diluted on Vero cells; (D) antiviral activities tested according to the wet-to-dry protocol; and (E) antiviral activities tested according to the wet-to-wet procedure. Clean silicon wafers were also tested in the same conditions as control. ? = below detection limit of 125 PFU/mL. “Untreated virus” stands for the original viral stock used for the test.
为了评估涂层抗病毒的活性，选择HSV-2型病毒。作者采用了两种不同的方案（湿-干和湿-湿）如图2A研究了涂层对HSV-2的抗病毒活性。这两种方案模拟了两种现实情况，湿-干方案允许病毒接种物在测试表面蒸发，该方案最接近现实情况。湿-湿方案则不允许病毒接种物的蒸发。为了评估木质素涂层的抗病毒活性，在75分钟（湿-干）或120分钟（湿-湿）后恢复病毒接种物后，通过菌斑试验测定HSV-2的感染性，其结果如图2B（湿-干）和图2C（湿-湿）所示。TALD-APH和苏打木质素显示病毒滴度低于检测限（>99%失活）；所有其他类型的木质素基本上显示出与硅晶片对照相当的活性。通过不同聚合物浓度的旋涂溶液获得的不同膜厚的卡夫木质素膜的分析表明，其未显示膜厚度对抗病毒活性的任何影响。为了了解病毒孵育时间如何影响抗病毒活性，我们根据湿-干和湿-湿方案对苏打木质素底物进行了抗病毒时间进程研究。从病毒孵育开始（t=0），在四个时间点（湿-干时间t=30、45、60、75分钟，湿至湿时间t=30、60、90、120分钟）回收病毒接种物。结果如图2D（湿-干）和图2E（湿-湿）所示。在干燥过程中（即病毒接种物在表面干燥的时间点和收集样品的时间点之间的时间段），湿-干时间过程显示病毒滴度显著下降，因为病毒在t＝30分钟时已经完全失活（即病毒接种物刚刚干燥）。湿-湿时间过程表明，在湿-湿条件下，总病毒灭活时间比湿-干情况下长（30至60分钟）。这种现象可能归因于病毒在干燥时的具有较低稳定性。
Figure 3. (A) Proposed ROS generation process: upon irradiation with visible light, lignin undergoes oxidation, which generates ROS asintermediates. (B) Wet-to-dry virucidal tests for soda lignin surfaces in the presence of L-ascorbic acid (AA). (C) Wet-to-dry virucidal tests for Soda lignin surfaces performed in the light, in the dark, and under N2. Clean silicon wafers were also tested in the same conditions as control. ? = below detection limit of 125 PFU/mL. “Untreated virus” stands for the original viral stock used for the test. (D, E) Time-dependent H2O2 generation from the lignin coatings detected by the FOX assay: (D) coatings irradiated with visible light with intensity 50 mW/cm2, (E) coatings kept in the dark. The data are reported as the average of at least three measures, and the error bars represent the standard deviation. (F) Concentration of the H2O2 generated from the different lignin coatings after 4 h of irradiation or in the dark, calculated using the calibration curve reported in Figure S5C (y-axes on the left), correlated with the lignin phenol concentration (y-axes on the right).
通过自由基中间体将木质素酚氧化成醌可诱导分子氧的减少和ROS的形成，进而有助于观察到表面涂层的抗病毒活性，如图3A即显示了一种抗病毒的机制。作者为了验证活性氧可能参与失活过程，在抗坏血酸(AA)存在的情况下进行了湿-干的抗病毒试验，AA是一种在生理条件下清除自由基和活性氧的还原剂。接种前将AA两种不同浓度(1和0.1 mg/mL)溶解到HSV-2病毒原液中，在碱木质素涂层和硅晶片(作为对照)上进行75 min的湿-干培养。图3B中报道的测试结果表明，碱木质素涂层的抗病毒活性在AA存在时降低。这一结果与我们关于ROS参与抗病毒机制的假设是一致的。
为了进一步证实推测的机制，湿-干抗病毒活性测试分别在黑暗或无氧条件下进行，这两种条件已知可以减少涂层ROS的生成。图3C中的结果显示，在这两种条件下，涂层的抗病毒活性急剧下降，这说明了ROS的作用。
作为一种模型ROS化合物，木质素涂层产生的H2O2通过铁氧化-二甲酚橙(FOX)法定量。为了在类似抗病毒测试的条件下测量涂层产生的H2O2，将涂层基质浸泡在pH=7.4的PBS中，并用可见光照射。作为对照，测试也在黑暗中进行，并对未涂覆的基板进行了测试。图3D(在光照下进行的测试)和图3E(在黑暗中进行的测试)总结了测试的结果。从最大吸光度值(560 nm)出发，利用校正曲线计算对应的H2O2浓度，并绘制在图3F中。光照射4 h后，苏打和TALD-APH木质素表面产生的H2O2是其他三种木质素表面的2~6倍。这一观察结果与这两种涂层所观察到的更强的抗病毒活性相一致。在黑暗中，每个时间点都检测到低浓度的H2O2，这与在无光情况下进行的湿转干试验中测定的抗病毒活性差一致。
将图3F中的结果与图2B、C和1E中的结果进行比较。图1E显示TALD-APH、Soda和Kraft木质素的总羟基含量差异不大，而图2B、C显示TALDAPH和Soda木质素的抗病毒活性差异较大，而Kraft木质素的抗病毒活性差异较大。这两组结果之间的差异反映了一个事实，即图1E所示的羟基含量是在溶液中测定的，而图2和图3所示的抗病毒活性和H2O2生成是在固体聚合物涂层上测定的。
Figure 4. (A) Wet-to-dry virucidal tests for soda lignin surfaces freshly prepared and stored for 6 months in ambient conditions in the dark or under the sunlight. (B) Wet-to-dry virucidal tests for Soda lignin surfaces and silver-coated surfaces. Clean silicon wafers were also tested in the same conditions as control. ? = below detection limit of 125 PFU/mL. “Untreated virus” stands for the original viral stock used for the test.
对碱木质素涂层的耐久性进行了为期6个月的测试。在此期间，涂层表面被储存在黑暗的环境条件下，或在实验室靠近窗户的地方，以便暴露在阳光下。如图4A所示，在两种条件下保存的涂层保持了抗病毒活性，并显示出对HSV-2的完全失活。在最后的实验中，将碱木质素基涂层的性能与银涂层表面进行比较，银涂层是一种著名的抗病毒材料，以其为基准。考虑到试验检出限为125 PFU/ mL，从图4B报道的结果来看，碱木质素和银的抗病毒活性具有可比性。
总结
作者通过旋涂造纸工业的天然生物质残留物—木质素来制备抗病毒表面涂层。研究显示，在低成本和环境可持续的表面涂层上，2型单纯疱疹病毒在30分钟内能有效灭活99%以上。与此同时，作者还研究了木质素表面的抗病毒机理，并将其归因于木质素酚氧化产生的活性氧物种。这种机制不消耗表面涂层（与特定抗病毒剂的释放相反），并且不需要再生。该涂层在环境条件下是稳定的，在6个月的老化研究中表明，抗病毒活性没有任何下降。这项研究表明，天然化合物木质素可用于开发负担得起且可持续的抗病毒涂层，为天然生物质材料在抗菌抗病毒方面开拓了新的思路。
